El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de trasmitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación.
%T = - Log Abs.
El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la mezcla).
Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a un largo de onda de luz específico para cada tipo de sustancia.
Funcionamiento
1.Encender el espectrofotómetro antes de realizar la prueba teniendo en cuenta el tiempo de termostatización recomendado por el fabricante.
2. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Si tiene un fotocolorímetro seleccione el filtro más próximo a la longitud de onda indicada.
3. Seleccionar la temperatura de trabajo.
4. Elegir una cubeta en buen estado (sin deformaciones ni suciedad)
5. Llevar a cero de absorbancia con agua destilada.
6. Vaciar la cubeta y enjuagarla con una pequeña porción de la solución a medir para evitar arrastre.
7. Cargar la cubeta con la solución y leer la absorbancia por duplicado informando la absorbencia promedio.
8. Si se debe medir más de una solución, enjuagar la cubeta con una porción de la solución antes de medir y leer como en el paso 7. Tener la precaución de empezar siempre por la solución más diluida.
Cuidados
1.Limpieza de la superficie del instrumento
2.Limpieza de los filtros y fuentes de luz
3.Verificar las instalaciones eléctricas
4.Asegurarse de que las cubetas estén limpias y sin ralladuras, sin huellas digitales. Esto es cada vez que se utilice.
